高强度间歇游泳运动对有训练大鼠心肌的差异表
间歇训练特别是高强度间歇运动对人体肌肉、心脏等器官都形成较大刺激，可显著增强心脏泵血功能、引起心脏生理性肥大（Ito et al.,2016），但同时又有引起心肌缺血、心肌纤维化等病理过程的潜在风险（饶志坚 等,2016；王林佳 等,2016）。随着表观遗传学的不断发展，有研究发现，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）可通过调控其靶基因表达而参与调节心肌细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程（钱帅伟 等,2014）。因此，可从间歇训练诱导miRNA及其靶基因表达变化的视角，研究间歇训练导致心脏重塑的可能调控通路。
miRNA 是一类广泛存在于动植物体内的小分子非编码RNA，长度约为18～25 个核苷酸，主要通过转录后水平的负性调控，实现对基因表达的调节作用（贾明学 等,2013）。已有研究表明，不同运动方式、强度和时间可引起心脏miRNA 的应答，影响基因表达和蛋白质的翻译，进而影响心脏功能，目前已证实有miR-1、miR-21、miR-24、miR-29、miR-133、miR-155、miR-146a、miR-208、miR-350、miR-30c 等参与运动心脏的重塑过程（饶志坚 等,2017a,2017b；王世强 等,2017；翟帅 等,2014；张振辉 等,2012；赵永才,2012），但以往研究结果倾向于对心脏功能的“良性”影响，而对“风险”miRNA 的客观研究和阐释不足。心脏功能的维持是众多呈现空间特异性与高度时效性表达的基因共同参与的结果，不同功能的基因共同组成一个复杂的调控网络，其中必然有许多能够响应间歇训练的miRNA参与对这些基因的调控。那么，除了目前发现的几种miRNA，心脏还有哪些能够响应间歇训练的运动刺激？参与调控的特异性miRNA 及其靶基因分别有什么作用？这些miRNA 调控其靶基因的机制为何？随着运动分子生物学的深入研究，这些问题将是今后研究的焦点问题。本研究旨在鉴定大鼠心脏中响应高强度间歇运动而差异表达的miRNA，并根据miRNA 与其靶基因的表达谱，解释大鼠心脏响应高强度间歇运动的基因表达调控通路。
1 材料与方法
1.1 研究对象与分组
选取健康雄性Wistar 大鼠20 只，随机分为2 组，对照（control check，CK）组10 只，高强度间歇游泳训练（high- intensity intermittent swimming training，HIST）组10 只。室温20℃～25℃，湿度45%～60%，光照时间14 h/天。动物经3 天时间适应环境后开始建模训练。
1.2 训练模型建立
课题组前期研究发现，有训练大鼠对一次高强度间歇运动的应激反应程度虽不如安静大鼠表现强烈，但同样能够反映一次HIST 的应激生理反应，且实验结果的一致性明显好于安静大鼠，数据离散程度更低，可靠性更高，因此，本研究选择有训练大鼠作为实验对象（张瑞萍 等,2011）。
根据Mcardle（1967）、Voltarelli（2002）的理论，参考徐玉林（1999）、严翊（2006）的研究方法，建立大鼠HIST 模型（张瑞萍 等,2011）。游泳条件：塑钢玻璃游泳池，长×宽×高为150×60×70 cm；泳池内水深为大鼠身体长度的2 倍，约60 cm；水温33℃～36℃。适应性游泳3 天，每天1 次，每次持续时间依次为第1 天15 min、第2天20 min、第3 天30 min，剔除不擅游泳者。随后开始正式间歇负重游泳训练，每周连续训练6 天，第7 天休息，共训练6 周。运动强度为尾部负重体重的5%，游泳持续6 min，休息4 min，每天连续进行10 轮；游泳期间观察记录大鼠的运动能力及活动状态，当大鼠浮在水面不运动时用木棒驱赶使其维持运动，当大鼠下沉水下无能力浮上时立刻托起减少负重至3%；训练结束后吹干毛发，放回鼠笼。
为判断模型是否建立成功，在第1 周第1 天训练前、第 1 天每 1 轮次后分别测量大鼠血乳酸（德国 EKF Lactate-Scout 血乳酸仪），依次标记为安静值、变化值1、变化值2、……、变化值10。CK 组不做任何运动，常规饲养，自由活动。
1.3 动物取材
第6 周第6 天HIST 组、CK 组均进行间歇负重游泳训练，结束后即刻进行动物取材。两组大鼠立即同时注射麻醉，并断颈处死，解剖出心脏左心室肌，立即放入液氮中冷冻。最后保存于-80℃冰箱中备用。
1.4 miRNA 分离与文库构建
在液氮中将每只大鼠左心室肌样品研磨成粉末，并用TRIzol 试剂（Invitrogen 公司）提取总RNA，将各RNA 样品按组等量混合成2 个RNA 样品池：HIST 组RNA 样品池与CK 组RNA 样品池。通过15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从各RNA 样品池中分别分离纯化出16～30 nt 的小RNA（sRNA）。然后用T4 RNA 连接酶在每个小RNA 的5'段和3'端加上接头，用SuperScript Ⅱ反转录酶（Invitrogen 公司）将其合成为cDNA，再经过RT-PCR 扩增获得双链cDNA。经10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、回收及纯化后的cDNA 用于构建sRNA 测序文库。采用NEB Next Ultra small RNA Sample Library Prep Kit for Illumina 试剂盒构建sRNA 测序文库。最后由北京百迈客生物公司在Illumina HiSeq2500 测序仪上进行高通量测序分析。
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