心脏细胞衰老与基因的缺失
0 引言 Introduction
细胞衰老是细胞不可逆地退出细胞周期，但保持活跃代谢的一种生理状态[1]，其特点包括细胞形态改变、线粒体和溶酶体功能障碍及衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)因子如炎症因子和趋化因子表达升高[1-2]。细胞衰老的发生可由多种因素导致，目前普遍认为，内环境稳态失衡、线粒体损伤及活性氧升高是导致细胞衰老的重要因素[3-4]。在分子水平，细胞衰老的发生和维持主要受p53和p16/Rb信号通路调控，其中p53激活后促使p21等一系列蛋白的表达，最终诱导细胞出现衰老样生长停滞[5-6]；而p16通过激活Rb抑制细胞周期蛋白激酶，从而在G1期阻滞细胞周期，导致细胞衰老[7]。目前认为p53/p21信号通路在复制性细胞衰老中起关键作用，而p16/Rb信号通路在早衰中至关重要。但是根据细胞类型和所处环境的不同，细胞衰老发生时，这2种信号通路可以同时或单独激活[8]。
细胞衰老在多种生理过程中如胚胎发育[9-10]、组织修复及机体器官衰老起重要作用[11-14]。此外，越来越多的证据表明衰老细胞随年龄增长在体内累积，是衰老相关疾病如心血管疾病、肿瘤和神经退行性疾病的重要机制[15-17]。大量研究发现，用药物或遗传学方法清除衰老细胞可以延长寿命、延缓器官衰老及缓解衰老相关疾病。如用化疗药物靶向衰老细胞可改善组织纤维化[18]；清除肥胖小鼠脂肪组织衰老细胞能够改善代谢功能障碍[19]；非瑟酮可以通过减少小鼠细胞衰老改善健康并延长寿命[20]；心脏细胞中Bmi1过表达能够抑制心脏细胞衰老从而改善扩张型心肌病及心力衰竭[21]。
研究表明在不同条件下，自噬既可以促进细胞衰老[22-23]，也可以抗细胞衰老[23-24]。在正常生理状态下，自噬通过清除细胞受损线粒体及活性氧从而维持细胞内环境稳态。随着年龄的增长，细胞自噬功能下降，导致细胞受损线粒体累积，活性氧升高，进而促进细胞衰老发生[25-26]。紫外线抵抗相关基因(ultraviolet resistance-associated gene，UVRAG)是自噬相关基因，具有多种生物学功能[27-28]。前期工作发现Uvrag基因缺失小鼠发生年龄相关心肌病伴有心功能下降，与细胞自噬受到阻断、细胞凋亡和炎症增加有关[29]。但细胞衰老是否为Uvrag基因缺失小鼠心肌病的发病机制尚不清楚。文章主要研究Uvrag基因缺失对心脏细胞衰老的作用。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 分组对照的动物实验。
1.2 时间与地点 2017年11月至2019年12月在上海交通大学生命科学技术学院Bio-X中心实验室完成实验和数据的分析工作。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 课题所用的Uvrag基因缺失小鼠的相关信息已报道，详见文献[29]。所用实验小鼠均是遗传背景为FVB/NJ的3月龄和8月龄雄性小鼠，Uvrag基因缺失小鼠由复旦大学发育生物学与分子医学研究所提供。Uvrag基因缺失杂合子雄性小鼠与Uvrag基因缺失杂合子雌性小鼠交配获得Uvrag基因缺失纯合子小鼠、Uvrag基因缺失杂合子小鼠和野生型小鼠。从上述Uvrag基因缺失纯合子小鼠和野生型小鼠中各取14只雄性小鼠分两批分别饲养到3月龄和8月龄。在无特殊病原菌级饲养条件下, 光照和黑暗时间均为12 h(光照：07：00-19：00，黑暗：19：00-次日07：00)。饲养环境维持恒温、恒湿及恒压。课题中所有动物实验均符合国际研究委员会指导准则及上海市动物福利与保护委员会的相关要求。
1.3.2 试剂 兔源性GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz公司)，兔源性p53多克隆抗体(Proteintech公司)，HRP标记的山羊抗兔IgG(麦约尔公司)，TRIzol总RNA提取试剂(生工生物工程公司)，苏木精-伊红染色液(南京建成生物工程研究所)，衰老相关-β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒(碧云天公司)，cDNA 合成(反转录)试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) system(Roche公司)，Western blot显影试剂盒ImmobilonTMwestern Chemiluminescent HRP substrate (Millipore公司 )，Uvrag基因引物及RT-PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)，蛋白酶K(Millipore公司)，Taq酶(碧云天公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验小鼠基因型鉴定Uvrag基因缺失小鼠基因型鉴定按文献[29]进行。提取鼠尾DNA作为小鼠基因型鉴定的模板。以GL，PB及GR引物用常规PCR方法对鼠尾DNA进行扩增，然后将PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳分离，通过观察PCR扩增条带大小判断相应小鼠Uvrag基因存在情况。GL，PB及GR引物序列如下：GL：5’-AAA AAT CAG AGG CCG GAG GAT TG-3’；PB：5’-CTG AGA TGT CCT AAA TGC ACA GCG-3’；GR：5’-TTT ACA GCA AGC AGC TTT CAA AAG G-3’。
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